Orang yang pertama menduduki kawasan yang kini dikenali sebagai Australia Selatan ialah orang asli Australia. Kehadiran mereka di utara Australia bermula sekitar 40,000 hingga 60,000 tahun yang lalu dengan kedatangan pertama nenek moyang mereka melalui jambatan tanah dari apa yang kini Indonesia. Keturunan mereka berpindah ke selatan dan, walaupun bilangan tidak pernah besar, menduduki seluruh kawasan Australia, termasuk Australia Selatan masa depan.[1]

Bukti kepada aktiviti manusia di Australia Selatan bertarikh kembali lebih daripada 65,000 tahun yang lalu dengan laman upacara dan seni batu di Flinders Ranges dan aktiviti perlombongan batu api dan batu seni di Gua Koonalda, Nullarbor Plain. Di samping itu tombak dan alat kayu telah dibuat di kawasan yang kini dilitupi paya gambut di tenggara. Pulau Kanggaru telah didiami lama sebelum pulau itu terputus oleh kenaikan aras laut.

Pada masa tersebut sejurus sebelum penempatan British Australia, terdapat sebilangan besar masyarakat dan bahasa yang berbeza di tempat yang kini Australia Selatan. Adalah tidak mustahil untuk dikatakan sekurang-kurangnya dua budaya dominan di Australia Selatan sebelum bertembung dengan orang Eropah, walaupun terdapat banyak masyarakat yang berbeza dalam setiap budaya ini. Yang pertama telah digelar "kumpulan Tasik" oleh ahli antropologi awal Elkin dan Howitt. Budaya "kumpulan Tasik" terbentang utara Gunung Lofty Ranges, sehingga ke Flinders Ranges ke sekitar Tasik Eyre, dan merentas Semenanjung Eyre. Perkumpulan budaya ini bercakap sekurang-kurangnya bahasa yang agak saling difahami, yang dikenali secara kolektif sebagai bahasa Thura-Yura. Mereka juga berkongsi ritual. Kumpulan utama kedua (dan masih sehingga hari ini) ialah "kumpulan Gurun Barat", atau blok budaya Gurun Barat. Kumpulan budaya ini merangkumi utara dan barat Tasik Eyre, dan barat Semenanjung Eyre. Ia mengunjur jauh di luar Australia Selatan ke Australia Barat dan Wilayah Utara. Budaya Gurun Barat bercakap bahasa yang sebahagian besarnya saling difahami, sehinggakan beberapa ahli bahasa percaya bahasa berasingan harus dipanggil dialek "bahasa Gurun Barat" yang lebih luas. Bahasa-bahasa ini adalah antara bahasa Orang Asli yang paling subur dalam Australia moden, termasuk Pitjantjatjara dan Yankunytjatjara. Kebudayaan lain yang wujud di Australia Selatan pada masa ini yang tidak sesuai ke dalam kumpulan di atas, seperti pelbagai masyarakat yang telah bertapak di sepanjang Sungai Murray, serta Ngarrindjeri dari Coorong dan kawasan Tasik Alexandrina, dan pelbagai masyarakat yang wujud di tenggara.